De nucleïnezuursynthese wordt uitgevoerd met behulp van de vaste fase siaalamidetriglyceridemethode, waarbij het 3'-uiteinde van het DNA wordt geïmmobiliseerd op een vaste fase-substraat en nucleotiden worden toegevoegd in de 3'-5'-richting totdat het gewenste DNA-fragment is gesynthetiseerd. .Dit verschilt van DNA-synthese door de toepassing van DNA-polymerase.
Het 3'-uiteinde van de eerste base wordt tijdens de synthese op CPG geïmmobiliseerd, de 5'-OH van de volgende base wordt beschermd met di-p-tolyltrityl DMT, de aminogroep op de base wordt beschermd met benzoëzuur en de 3'-uiteinde van de eerste base wordt beschermd met benzoëzuur. -OH wordt vervolgens geactiveerd met een aminofosfaatverbinding.1 base van de 5 5′-OH van 1 base en 3′-OH van de volgende base vormen een fosfiettriglyceride, dat vervolgens met jodium wordt geoxideerd tot een fosfaattriglyceride, het beschermmiddel op de tweede base 5′-OH wordt verwijderd door het toevoegen van dichloorazijnzuur DM-cycli door de toevoeging van de volgende base, en na synthese wordt het beschermmiddel op de 5′-OH verwijderd met een zwak zuur. Het fragment wordt losgemaakt van de vaste hars met geconcentreerd ammoniumhydroxide, het beschermmiddel wordt van de base verwijderd met geconcentreerd ammoniumhydroxide onder verwarming wordt het ammoniumhydroxide verwijderd, het fragment wordt onder vacuüm gedroogd en het nucleïnezuur wordt gezuiverd door middel van vloeistofchromatografie of PAGE.
Stappen van Oligo-synthese
Deblokkeren
DeDe 5-eind DMT-beschermende groep wordt verwijderd door toevoeging van TCA-oplossing.
Activering
Het mengen van de activator met het oligonucleotidemonomeer om het actieve oligonucleotidemonomeertussenproduct te vormen.
Koppelen
De 5-terminale hydroxylgroep reageert met het actieve oligonucleotide-tussenproduct in een anti-generatieve condensatiereactie om een onstabiele fosfiettriglyceridebinding te vormen.
Afdekken
De toevoeging van een afdekkingsmiddel voert een acetyleringsafdekkingsreactie uit met overmatige hydroxylgroepen die niet betrokken zijn bij de condensatiereactie.
Oxidatie
De toevoeging van een jodiumoplossing die water bevat, reageert met onstabiele fosfietbindingen door oxidatie om stabiele fosforzuurtriglyceridebindingen te vormen.
Cyanoethyl-splitsing
Het nucleïnezuurproduct na synthese, met toevoeging van DEA-oplossing om de cyaanethylgroep van de fosfaattriglyceridebinding te verwijderen.
Gesplitst en ontschermd
De nucleïnezuurfragmenten worden van de vaste fase-drager gesplitst door het toevoegen van een geconcentreerde ammoniumhydroxideoplossing en vervolgens verwarmd om de beschermende groepen van de waterstofbruggen van de basen te verwijderen.
Posttijd: 21 november 2022